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生物TEM組織取材步驟及注意事項

發布時間:2025-06-14 點擊:21
1、定位準確:取材部位解剖水平的準確定位要求誤差應 ≤ 1mm。注意各組實驗動物組織取材區位及方位的一致性和代表性。
2、操作迅速:組織離開活體后,以最快的速度浸入醛類固定液,0.5 min或最多2 min。 先準備好2mlEP管,里面盛滿預冷的醛類固定液。提示:最好在解剖前做灌注固定,而對腦、脊髓、睪丸等組織則必須做灌注固定。
3、標本尺寸大小:組織塊的粒徑大小必須與固定液的穿透率(≤0.5mm)相適應,樣品塊過大,內部固定不良;樣品過小,觀察內容受限。可參照下圖取材。提示:把較大標本塊修整成符合要求的形狀時,須事先準備一個蠟盤,滴入醛類固定液,把標本浸在液滴中修整,確認每個小標本條都包含需要的結構內容,再用牙簽挑出三小塊,放入2ml EP管,密閉,4℃保存。
4、操作輕柔、清潔:取材操作動作始終保持輕柔,盡可能避免金屬器具對組織的夾持、擠壓或牽拉,所用器具必須清潔,使用緩沖液清洗。
5、保持低溫環境:為降低自溶酶活性,在4℃低溫條件下取材,容器和器械預冷;將修整好的標本塊放入醛類固定液后,4℃冰箱保存。
提示:
?初固定之后,盡早進入制備程序;存放3天以上,須更換固定液。
?注意:既要保持低溫,又要避免EP管接觸冰塊,固定液 要充滿標本小瓶,蓋緊瓶蓋,用膠布加固,以免郵寄途中液體滲出。
為了得到精美的TEM照片,請務必認真做好最關鍵的第一步取材!
1、確認細胞數量≥105,根據研究目的,選擇最佳取材時間;
2、調整醛類固定液pH與培養基pH相同并等滲;
3、貼壁細胞用柔軟細胞刮子輕輕刮起,成細胞懸液;
4、把細胞懸液置入潔凈離心管,或圓底EP管(2ml);
5、選擇合適的離心速度和時間,3000-5000轉,5~10分鐘,形成細胞團塊;
6、用牙簽輕輕挑起細胞團塊,若致密柔韌,即棄上清,注入新鮮醛類固定液,4℃保存;
7、及時送實驗室,進入電鏡樣品制備程序。
提示:
A.取離心好的細胞團塊時,如細胞分散開,可在離心管中注入約5μl血清再離心,至EP管底部出現致密細胞團塊。
B. 細胞大小不同,最佳離心富集速率和時間不同。事先檢索文獻,避免反復離心損傷細胞。
C. 在上述第(5)步驟之前,用緩沖液離心1~2次,可以清除培養基中的雜質。但此 操作要注意:緩沖液要新鮮,緩沖液與培養基等滲,pH近似。由于各實驗室配制緩沖液方法和保存時間等差別很大,由緩沖液欠佳帶來的損傷不容忽視,請使用前斟酌。
D. 快遞標本注意:
?4℃保存;
?避免標本瓶直接接觸冰塊;
?固定液要充滿樣品容器,確認蓋緊瓶蓋,最好用膠布加固,以免郵寄途中液體滲出(此種情況常見)。


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